顯微鏡的結構和使用的實驗方法及步驟 - 分析行業新聞

以生物顯微鏡為例，講述一下原理、構造和實驗方法、步 驟。

一、光學顯微鏡的原理

普通光學顯微鏡主要由物鏡和目鏡組成，均為凸透鏡。物鏡的焦距（f1）短，目鏡的焦距（f2）長。物鏡到標本（AB）的距離稍大于物鏡（Lo）的焦距，標本經物鏡放大后，形成放大倒立的實像A’B’，實像A’B是目鏡的物體，它位于目鏡的焦點以內，所以 A’B’經目鏡（Le）再次放大后，形成放大的虛像A”B”（如圖1）。

                          圖1 光學顯微鏡成像原理

二、顯微鏡的結構：

普通光學顯微鏡由機械部分、照明部分和光學部分組成（如圖2）。

                                      圖2 光學顯微鏡結構

1. 機械部分：

顯微鏡的機械部分包括鏡座、鏡筒、物鏡轉換器、載物臺、推動器、粗調手輪、微調手輪等部件。

1）鏡座：鏡座是顯微鏡的基本支架，它由底座和鏡臂兩部分組成。其上連有載物臺和鏡筒，它是用來安裝光學放大系統部件的基礎。底座和鏡臂起穩定和支撐整個顯微鏡的作用。

2）鏡筒： 鏡筒上接接目鏡，下接轉換器，形成接目鏡與接物鏡（裝在轉換器下）間的暗室。從物鏡的后緣到鏡筒尾端的距離稱為機械筒長。因為物鏡的放大率是對一定的鏡筒長度而言的。鏡筒長度的變化，不僅放大倍率隨之變化，而且成像質量也受到影響。因此，使用顯微鏡時，不能任意改變鏡筒長度。國際上將顯微鏡的標準筒長定為160mm，此數字通常標在物鏡的外殼上。鏡筒有單筒式、雙筒式兩種，單筒式鏡筒又分直立和傾斜式，而雙筒式鏡筒均為傾斜式。

3）物鏡轉換器：物鏡轉換器上可安裝三至四個接物鏡，一般是三個接物鏡（低倍、高倍和油鏡）。轉動轉換器，可以按需要將其中的一個接物鏡和鏡筒對齊（注意是轉動轉換換選鏡頭，不能抓著物鏡鏡頭轉），與接目鏡構成放大系統。

4）載物臺：載物臺中央有一孔，為光線通道。在臺上裝有彈簧標本夾和推動器，其作用為固定和移動標本的位置，使得鏡檢對象恰好位于視野中心。

5）推動器：是移動標本的機械裝置，它是由一橫一縱兩個推進齒軸的金屬架構成的，好的顯微鏡在縱橫架桿上刻有刻度標尺，構成很精密的平面座標系。如果我們需要重復觀察某一部分,可記下縱橫標尺的數值，以后移動到同樣數值即可找到。

6）粗調手輪（粗螺旋）：粗調手輪是快速移動調節接物鏡和標本間距離的機件。

7）微調手輪（細螺旋）：用粗調手輪只可以粗略地調節焦距，要得到*清晰的物象，需要使用微距螺旋做精調。

2. 照明部分

安裝在載物臺的下方，由反光鏡（或光源）、聚光器和光圈組成。

1）反光鏡：早期光學顯微鏡是用自然光檢視物體，在鏡座上裝有反光鏡。反光鏡是由一平面和另一凹面的鏡子組成，可以將投射在它上面的光線反射到聚光器透鏡用以照明標本。也有用凹面鏡會聚光線的。現代光學顯微鏡普遍采用電光源，無反光鏡，并可調節光照強度。

2）聚光器：聚光器在載物臺下面，它是由一組聚光透鏡和升降螺旋組成的。聚光器安裝在載物臺下，其作用是將光源經反光鏡反射來的光線聚焦于樣品上，以得到*強的照明，使物象獲得明亮清晰的效果。聚光器的高低可以調節，使焦點落在被檢物體上，以得到*大亮度。一般聚光器的焦點在其上方1.25mm處，而其上升限度為載物臺平面下方0.1mm。因此，要求使用的載玻片厚度應在0.8~1.2mm之間，否則被檢樣品不在焦點上，影響鏡檢效果。

3）光圈：聚光器前透鏡組前面還裝有虹彩光圈，它可以開大和縮小，控制通過的光量，從而影響著成像的分辨力和反差，若將虹彩光圈開放過大，超過物鏡的數值孔徑時，便產生光斑；若收縮虹彩光圈過小，分辨力下降，反差增大。因此，在觀察時，通過虹彩光圈的調節再把視場光闌（帶有視場光闌的顯微鏡）開啟到視場周緣的外切處，使視場外得不到光線的照明，以免散射光的干擾。

3. 光學部分

1）目鏡：安裝在鏡筒上端，有單筒和雙筒目鏡，常用5×、10×、15×和20×的目鏡。

2）物鏡：安裝在轉換器上的接物透鏡使被檢物體成一次像，物鏡成像的質量，對分辨力有著決定性的影響。一般有3-4個物鏡（如圖3），通常在物鏡上標有主要性能指標即放大倍數和鏡口率，如10/0.25、40/0.65和100/1.30。

                                           圖3  顯微鏡物鏡鏡頭

物鏡的種類很多，可從不同角度來分類： 根據物鏡前透鏡與被檢物體之間的介質不同，可分為：

①干物鏡  以空氣為介質，如常用的40×以下的物鏡，數值孔徑均小于1。

②油浸物鏡  常以香柏油為介質，此物鏡又叫油鏡頭，其放大率為90×~100×，數值孔值大于1。

數值孔徑（numerical apeature，N.A.），也叫做鏡口率（或開口率）。在物鏡和聚光器上都標有它們的數值孔徑，數值孔徑是物鏡和聚光器的主要參數，也是判斷它們性能的*重要指標。物鏡的性能取決于物鏡的數值孔徑，數值孔徑越大，物鏡的性能越好。數值孔徑和顯微鏡的各種性能有密切的關系，它反映該物鏡分辨力的大小，數值越大，其分辨力越高。

工作距離指物像調節清楚時物鏡下表面與蓋玻片上表面之間的距離；物鏡的放大倍數越大，工作距離越小。

2. 光學顯微鏡的使用方法及實驗:

實驗用品

材料與標本：字片、紅綠羊毛交叉片、人血涂片。

器材：顯微鏡、擦鏡紙。

試劑：香柏油、二甲苯(或乙醚-酒精混合液，比例為2:3）。

1）10×低倍鏡的使用

①將顯微鏡放在離實驗臺邊緣6~7厘米處（至少約一拳的距離）。

②打開顯微鏡的電源開關，然后使低倍鏡對準鏡臺，開大光圈，上升聚光器并調節光亮調節旋鈕至視野內光線明亮度適中。

③放置標本片：取一張載有標本的載玻片（以下簡稱玻片標本），先用肉眼觀察，以確定止反面（載有標本的面為正面，一般都貼有標簽）和標本的大致位置。再將玻片標本正面朝上放置在載物臺并用彈簧夾夾好，用移動器移動片夾將玻片標本的標本移到載物臺圓孔，聚光鏡的正上方。

④調節焦距：從顯微鏡側面注視物鏡鏡頭，同時轉動粗調手輪，使得載物臺上升到*高（物鏡頭與標本片的距離約5mm處），然后一邊在目鏡上觀察，一邊緩慢轉動粗調手輪，使載物臺緩慢下降至視野中出現清晰的物像。

2）40×高倍鏡的使用

①選擇目標：一定先在低倍鏡下把待觀察部位移動到視野中心,將物像調節清晰。

②轉換高倍鏡物鏡：為防止鏡頭碰撞玻片，可從顯微鏡側面觀察。慢慢地轉動轉換器使高倍鏡頭對準通光孔。

③調節焦距：觀察目鏡同時稍稍調節細調手輪，即可獲得清晰的物像。若視野不夠明亮，可上升聚光器和開大光圈。

3）100×油鏡的使用

① 選擇目標：在高倍鏡下確定玻片標本上待觀察部位并移至視野正中央。

② 轉換油鏡：轉動轉換器，使高倍鏡頭離開通光孔，在載物臺圓孔上方的玻片標本處滴一滴香柏油。然后從側面注視著鏡頭與玻片，慢慢轉換油鏡使鏡頭浸入油中。

③ 調節光亮：將聚光器升到*高位置，光圈開到*大。

④ 調焦：觀察目鏡同時調節細調手輪，使得物像清晰

若目標不理想或不出現物像需重找，在加油區之外重找應按：低倍→高倍油鏡程序。在加油區內重找應按：低倍→油鏡程序，以免油沾污高倍鏡頭。

⑤ 擦拭油鏡頭：觀察完畢，先用干的擦鏡紙吸掉粘在油鏡頭上的油，再用擦鏡紙條沾少許二甲苯(或乙醚-酒精混合液，比例為2:3)擦試鏡頭及周圍，*后用干的擦鏡紙擦干多余的二甲苯。
⑥ 玻片標本上的油處理方法同上，只是因為玻片上的油較多，要重復2-3次才能擦干凈。

4）實驗記錄結果與記錄

①低倍鏡的練習

比較肉眼直接觀察字片與低倍鏡下觀察物像的有什么區別?左右前后移動玻片與低倍鏡下觀察到的物像有什么區別？

②高倍鏡的練習

取紅綠羊毛交叉片，先在低倍鏡下找到羊毛，并將紅綠羊毛的交叉點移到視野的中心，再換高倍鏡觀察，能否在交叉點同時看到兩根羊毛（利用細螺旋進行判斷）。

③油鏡的練習

取人血涂片，先用低倍鏡、高倍鏡觀察，再換油鏡觀察。比較三種放大倍數的物鏡的分辨力并練習擦拭油鏡頭和標本片。

三、注意事項

1. 移動顯微鏡時一定要一手握住鏡臂，另一手托住底座。顯微鏡不能傾斜，以免目 鏡從鏡筒上端滑出。要輕拿輕放。

2. 顯微鏡的光學部分，只能用特殊試鏡紙紙擦拭，不得隨意使用其它物品擦拭，更不可用手指觸摸透鏡，以免汗液玷污透鏡。

3. 需要更換標本片時，將物鏡頭轉離載物臺 ，方可取下或放置標本片。

4. 保持顯微鏡的清潔，避免灰塵、水及化學試劑的玷污。

5. 轉換物鏡鏡頭時，不要搬動物鏡鏡頭，應轉動轉換器。

6. 切勿隨意轉動粗準焦螺旋。使用細準焦螺旋時，用力要輕，轉動要慢，轉不動時不要硬轉。

7. 不得任意拆卸顯微鏡上的零件，嚴禁隨意拆卸物鏡鏡頭，以免損傷轉換器螺口，或螺口松動后使低高倍物鏡轉換時不齊焦、破壞光軸重合。

8. 在使用高倍物鏡時，不要用粗準焦螺旋調節焦距，以免移動間隔過大，損傷物鏡和玻片。

9. 保持顯微鏡的干燥。

10. 顯微鏡使用完畢，必須復原，其具體步驟是：先轉動轉換器使物鏡頭離開通光孔，再取下標本片，下降載物臺，下降聚光器、關閉光圈，玻片移動器回位，將顯微鏡電光源的亮度調到*暗，再關閉電源，蓋上綢布和外罩，*后將顯微鏡放在桌子的中央。